Professor Layton erhält von einer seiner ehemaligen Studentinnen, der Opernsängerin Janice Quatlane, einen Brief. Er enthält Operntickets und einen Bericht, in dem Janice erzählt, dass eine Freundin von ihr ein Jahr zuvor verstorben und nun in Gestalt eines siebenjährigen Mädchens wieder aufgetaucht sei. Das Mädchen behauptet: Ich habe das ewige Leben erlangt.
Um diesem Rätsel auf den Grund zu gehen, machen sich Professor Layton, Luke und Laytons Assistentin Remi auf die … mehrReise, um die Oper im Crown Petone Theater zu sehen. Die Oper, eine neue Komposition des Pianisten Oswald Whistler, beruht auf Forschungsarbeiten des Mentors von Professor Layton Dr. Schrader, und behandelt die Legende des uralten Königreichs Ambrosia, dem Land des ewigen Lebens. Der wahre Grund, aus dem die meisten der Zuschauer an diesem Abend in die Oper kommen, ist nicht die Musik, sondern das Versprechen des ewigen Lebens. Als sich der Vorhang öffnet, betritt ein maskierter Mann die Bühne und eröffnet ein Rätsel-Spiel, an dessen Ende eine Person die Unsterblichkeit gewinnen wird Die Handlung des Filmes ist nach dem 4. Layton-Spiel angesiedelt, in dem Luke Laytons Schüler das Konzept der Unsterblichkeit erforscht. Masakazu Kubo, der ausführende Produzent der Pokémon-Filme, hat die erfolgreiche Serie der Professor-Layton-Denkspiele für Ninteno DS in einen abendfüllenden Zeichentrickfilm verwandelt. Spielentwickler Akihiro Hino von LEVEL-5 hat die Professor-Layton-Spiele wegen seiner lebenslangen Vorliebe für Denksporträtsel erfunden. Das Drehbuch stammt aus der Feder von Autorin Aya Matsui, die bereits für Dragonball Z, Dragonball GT oder Ranma ½ verantwortlich war. weniger